Methodologie pour l'analyse par HPLC de pigments phytoplanctoniques au LOV (Laboratoire d’Océanographie de Villefranche sur mer) de 1999 à 2004.

Echantillonnage et conservation: 2 à 2.8 litres d'eau prelevés et  filtrés sur filtres en fibre de verre Whatman GF/F (0.7µm). Stockage à -25°C jusqu'à l'analyse.

Extraction et analyse (loin de toute source de lumière): extraction des filtres à -20°C pendant 30min dans 3mL de methanol 100% °+ standard interne (beta-apo-carotenal). Broyage des filtres aux ultrasons puis retour au congelateur pendant 30min. Clarification des extraits à travers des filtres Whatman GF/C (1.2µm) et analyse par HPLC le même jour.

La methode utilisée de 1999 à 2004 etait dérivée de celle de Vidussi et al. (1996) avec une colonne C8 en pahse inverse plus etroite, l'objectif étant d'ameliorer la sensiblité. Elle permettait d'avoir une resolution complète de la DV Chla et Chla et une resolution partielle de la zeaxanthin et lutein. Claustre et al. (2004) fournit une description détaillée de la méthode.

 

Le système HPLC comporte un degzeur, une pompe binare, un detecteur à barettes de diodes reglé à 440 et 667nm (Agilent Technologies 1100), un injecteur automatique refrigéré et un fluorimetre (Thermoquest AS3000 puis Agilent Technologies à partir de 2003) et une colonne en phase inverse C8, Hypersil, 3µm (3 x 100mm). Le logiciel Chemstation for LC (A 06.03) de Agilent Technologies permet le pilotage de l'instrument.

 La méthode d'analyse etait basée sur une separation en gradient entre un melange methanol:acetate d'ammonium (70:30) et une solution de 100% methanol, comparable à celle décrite par Vidussi et al. (1996) mais avec quelques différences permettant d'ameliorer la sensiblité. Les principales caractéristiques de la méthode entre 1999 et 2004 sont resumés ci-dessous:

Débit    0.5 mL/min
Temperature de colonne    25°C
Solution tampon    Ammonium acetate 1N, melangé avec l'échantillon avant injection
Durée d'analyse    23 minutes
Gradient de solvents    Solvent A: 70% Methanol + 30% Ammonium acetate 0.5N
Solvent B: 100% Methanol (HPLC grade)
Programme gradient     t=0 min: 80% A, 20 % B; t=4,7 min: 50% A, 50% B; t=18,7 min: 0% A, 100% B; t=22.7 min: 0% A, 100%B
Volume d'injection (echantillon+ tampon)    125+125=250 µL

Quantification et Calibration: Chlorophylles et carotenoides étaient detectés et quantifiés (surface de pics) à partir du signal à 440nm. Identification des pigments a été effectuée avec les temps de rétention et comparaison des spectres d'absorption des pics avecceux d'une bibliothèque spectrale créee à partir d'etalons et cultures de reference. La quantification des pigments associés à la chlorophylle a (chlorophyllide a et phaeophorbide a, qui coeluent avec les carotenoids à 440nm) etait également effectuée à partir du signal à 667nm. Lorsque deux pigments coéluaient à une longueur d'onde donnée, on procèdait à l'identification spectrale puis on faisait la somme de ces 2 pigments. (Example: chlorophyll c1+c2; or Total chlorophyll b = chlorophyll b + divinyl chlorophyll b)

Les differents pigments quantifiés entre 1999 et 2004 sont representés dans la table suivante:

PIGMENTS (en ordre de temps de retention); longueur d'onde;observations
1. Chlorophyll c3; 440    
2. Chlorophyllide a; 667; coelution with chlc1+c2
3. Chlorophyll c1+c2; 440    
4. Phaeophorbide; 667; coelution with peridinin
5. Peridinin; 440    
6. 19’-butanoyloxyfucoxanthin; 440    
7. Fucoxanthin; 440    
8. 19’-hexanoyloxyfucoxanthin; 440; Coelution with prasinoxanthin
9. Neoxanthin + violaxanthin; 440; coelution
10. Diadinoxanthin; 440    
11. Alloxanthin; 440    
12. Diatoxanthin; 440    
13. Zeaxanthin; 440    
14. Lutein; 440    
15. Non-polar chlorophyll c1; 440    
16. Total chlorophyll b = chlorophyll b + divinyl chlorophyll b; 440, 667;    coelution
17. Crocoxanthin; 440    
18. Divinyl chlorophyll a; 440    
19. Chlorophyll a = chlorophyll a + allomers + epimers; 440, 667    
20. Non polar chlorophyll c2; 440    
21. Carotenes = α-caroten + β-caroten; 440; coelution
22. Phaeophytin a; 667    

 

Les limites de detection de la chlorophylle a and fucoxanthine (basée sur un rapport signal/bruit de 3 et un volume filtré de 2,8L) ont été estimés à 0.0014 mg.m^-3 and 0.0023 mg.m^-3 respectivement.

 

References

Claustre H., Hooker S.B., Van Heukelem L., et al., 2004. An intercomparison of HPLC phytoplankton pigment methods using in situ samples: application to remote sensing and database activities. Marine Chemistry 85:41-61.
Vidussi, F., Claustre, H., Bustillos-Guzman, J., Cailliau, C., Marty, J.C., 1996. Determination of chlorophylls and carotenoids of marine phytoplankton : separation of chlorophyll a from divinyl-chlorophyll a and zeaxanthin from lutein. Journal of Plankton Research 18, 2377-2382.