Methodologie pour l'analyse par HPLC de pigments phytoplanctoniques au LOV (Laboratoire d’Océanographie de Villefranche sur mer) jusqu'en 1998.

Echantillonnage et conservation: 2 à 2.8 litres d'eau prelevés et  filtrés sur filtres en fibre de verre Whatman GF/F (0.7µm). Stockage à -25°C jusqu'à l'analyse.

Extraction et analyse (loin de toute source de lumière): extraction des filtres à -20°C pendant 30min dans 3mL de methanol 100% °+ standard interne (beta-apo-carotenal). Broyage des filtres aux ultrasons puis retour au congelateur pendant 30min. Clarification des extraits à travers des filtres Whatman GF/C (1.2µm) et analyse par HPLC le même jour.

La methode utilisée jusqu'en 1993 etait dérivée de celle de Mantoura et Llewellyn (1983). La procedure d'analyse, identification et quantification a été décrite par Claustre et al. (1994). La séparation en phase inverse avec une colonne C18 permettait une resolution partielle de divinyl chlorophylle a (DV Chla) et Chlorophylle a (Chla).
Entre 1994 et 1998, la méthode décrite par Vidussi et al. (1996) etait basée sur une colonne en phase inverse C8, permettant une resolution complète de la DV Chla et Chla et une resoltion partielle de la zeaxanthin et lutein.

 Avant 1997, l'instrumentation comprenait une pompe LCD Milton Roy, une colonne C18 Hypersil ODS 3m (4.6 x 100 mm) et 2 spectrophotometres (LCD spectro monitor SM 3000 et SM 3100) avec des longueurs d'one d'acquisition de 440 et 667 nm respectivement.

L'elution en gradient est decrit par Williams et Claustre (1991), sauf pour le debit qui etait de 1 mL/min. Les surfaces de pics etaient enregistrés et calculés avec le logiciel Nelson Analytical.

 Depuis 1997, le system HPLC comporte un degzeur, une pompe binare, un detecteur à barettes de diodes reglé à 440 et 667nm (Agilent Technologies 1100), un injecteur automatique refrigéré et un fluorimetre (Thermoquest AS3000) et une colonne en phase inverse C8, Hypersil, 3µm (4,6 x 100mm). Le logiciel Chemstation for LC (A 06.03) de Agilent Technologies permet le pilotage de l'instrument.
La méthode d'analyse etait basée sur une separation en gradient entre un melange methanol:acetate d'ammonium (70:30) et une solution de 100% methanol. Les principales caractéristiques de la méthode (Vidussi et al., 1996) depuis 1994 sont resumés ci-dessous:

 

Débit    1 mL/min
Temperature de colonne    ambiante
Solution tampon    Ammonium acetate 1N, melangé avec l'échantillon avant injection
Durée d'analyse    19 minutes
Gradient de solvents    Solvent A: 70% Methanol + 30% Ammonium acetate 0.5N
Solvent B: 100% Methanol (HPLC grade)
Programme gradient     t=0 min: 75% A, 25 % B; t=1 min: 50% A, 50% B; t=15 min: 0% A, 100% B; t=18.5 min: 0% A, 100%B; t=19 min: 75% A, 25%B
Volume d'injection (echantillon+ tampon)    200 µL

Quantification et Calibration: Chlorophylles et carotenoides étaient detectés et quantifiés (surface de pics) à partir du signal à 440nm. Identification des pigments a été effectuée avec les temps de rétention et comparaison des spectres d'absorption des pics avecceux d'une bibliothèque spectrale créee à partir d'etalons et cultures de reference. La quantification des pigments associés à la chlorophylle a (chlorophyllide a et phaeophorbide a, qui coeluent avec les carotenoids à 440nm) etait également effectuée à partir du signal à 667nm. Lorsque deux pigments coéluaient à une longueur d'onde donnée, on procèdait à l'identification spectrale puis on faisait la somme de ces 2 pigments. (Example: chlorophyll c1+c2; or Total chlorophyll b = chlorophyll b + divinyl chlorophyll b)

Les differents pigments quantifiés avant 1998 sont representés dans la table suivante:

 

PIGMENTS (en ordre de temps de retention); longueur d'onde;observations
1. Chlorophyll c3; 440    
2. Chlorophyllide a; 667; coelution with chlc1+c2
3. Chlorophyll c1+c2; 440    
4. Phaeophorbide; 667; coelution with peridinin
5. Peridinin; 440    
6. 19’-butanoyloxyfucoxanthin; 440    
7. Fucoxanthin; 440    
8. 19’-hexanoyloxyfucoxanthin; 440; Coelution with prasinoxanthin
9. Neoxanthin + violaxanthin; 440; coelution
10. Diadinoxanthin; 440    
11. Alloxanthin; 440    
12. Diatoxanthin; 440    
13. Zeaxanthin; 440    
14. Lutein; 440    
15. Non-polar chlorophyll c1; 440    
16. Total chlorophyll b = chlorophyll b + divinyl chlorophyll b; 440, 667;    coelution
17. Crocoxanthin; 440    
18. Divinyl chlorophyll a; 440    
19. Chlorophyll a = chlorophyll a + allomers + epimers; 440, 667    
20. Non polar chlorophyll c2; 440    
21. Carotenes = α-caroten + β-caroten; 440; coelution
22. Phaeophytin a; 667    

 

References
Claustre, H., Kerhervé, P., Marty, J.C., Prieur, L., Videau, C., Hecq, J.H., 1994. Phytoplankton dynamics associated with a geostrophic front: ecological and biogeochemical implications. Journal of Marine Research 52, 711-742
Mantoura, R.F.C., Llewellyn, C.A., 1983. The rapid determination of algal chlorophyll and carotenoid pigments and their breakdown products in natural waters by reverse-phase high-performance liquid chromatography. Analytica Chimica Acta 151, 293-314.
Vidussi, F., Claustre, H., Bustillos-Guzman, J., Cailliau, C., Marty, J.C., 1996. Determination of chlorophylls and carotenoids of marine phytoplankton : separation of chlorophyll a from divinyl-chlorophyll a and zeaxanthin from lutein. Journal of Plankton Research 18, 2377-2382.
Williams R. and Claustre H., 1991. Photosynthetic pigments as biomarkers of phytoplankton populations and processes involved in the transformation of particulate organic matter at the Biotrans site(47°N, 20°W). Deep Sea Research 38(3): 347-355.