Methodologie pour l'analyse par HPLC de pigments phytoplanctoniques au LOV (Laboratoire d’Océanographie de Villefranche sur mer) depuis 2004.

Echantillonnage et conservation:

2 à 2.8 litres d'eau prelevés et  filtrés sur filtres en fibre de verre Whatman GF/F (0.7µm). Stockage dans l'azote liquide puis à -80°C  jusqu'à l'analyse.

 

Extraction et analyse (loin de toute source de lumière):

• • • De 2004 à 2006

Extraction des filtres à -20°C pendant 30min dans 3mL de methanol 100% + standard interne (Vitamine E acétate). Broyage des filtres aux ultrasons puis retour au congelateur pendant 30min. Clarification des extraits à travers des filtres Whatman GF/C (1.2µm) et analyse par HPLC le même jour.

• Depuis 2006:

Extraction des filtres à -20°C pendant 1h dans 3mL de methanol 100% + standard interne (Vitamine E acétate). Broyage des filtres aux ultrasons puis retour au congelateur pendant 1h. Clarification des extraits à travers des filtres Whatman GF/F (0.7µm) et analyse par HPLC le même jour.

 

La méthode d'analyse est basée sur une separation en gradient entre un melange methanol:tetrabutylammonium acetate (28mM, pH6.5) (70:30) et une solution de 100% methanol, tel que décrit par Ras et al. (2008).

Elle est dérivée de celle de Van heukelem et Thomas (2001) avec une colonne C8 en phase inverse plus etroite, l'objectif étant d'ameliorer la sensiblité. Elle permet d'avoir une resolution complète de la DV Chla et Chla, une resolution partielle (>1) de la zea et lut mais aussi une séparation presque complete de la 19HF et de la prasino, viola  et neo. Ras et al. (2008) fournit une description détaillée de la méthode. Pour la première fois la bacteriochlorophylle a est quantifiée de façon routinière.

Le système HPLC comporte un degazeur, une pompe binare, un injecteur automatique refrigéré (à 4°C), un thermostat pour colonne, un detecteur à barettes de diodes reglé à 450, 667, 770 et 222nm et un fluorimètre (Agilent Technologies 1100 et 1200). Le logiciel Chemstation for LC (A 06.03) de Agilent Technologies permet le pilotage de l'instrument.

 

Les principales caractéristiques :

Débit :   0.55 mL/min

Colonne: Zorbax Eclipse XDB, 3x150mm, 3.5µm.

Temperature de colonne :   60°C
Solution tampon :   Tetrabutylammonium acétate 28mM (pH=6.5), melangé avec l'échantillon avant injection
Durée d'analyse :   28 minutes
Gradient de solvents:     Solvent A: 70% Methanol + 30% Tetrabutylammonium acétate
Solvent B: 100% Methanol (HPLC grade)
Programme gradient :    t=0 min: 90% A, 100 % B; t=22 min: 5% A, 95% B; t=28 min: 5% A, 95% B
Volume d'injection (echantillon+ tampon) :   125+125=250 µL

 

Quantification et Calibration:

Chlorophylles et carotenoides étaient detectés et quantifiés (surface de pics) à partir du signal à 450nm. Identification des pigments a été effectuée avec les temps de rétention et comparaison des spectres d'absorption des pics avec ceux d'une bibliothèque spectrale créee à partir d'etalons et cultures de reference. La quantification des pigments associés à la chlorophylle a (chlorophyllide a phaeophorbide a et phaeophytine a, qui coeluent avec les carotenoids à 450nm) etait également effectuée à partir du signal à 667nm. Lorsque deux pigments coéluent à une longueur d'onde donnée, on procède à l'identification spectrale puis on fait la somme de ces 2 pigments. (Example: chlorophyll c1+c2; or Total chlorophyll b = chlorophyll b + divinyl chlorophyll b)

Les differents pigments quantifiés depuis 2004 sont representés dans la table suivante:

PIGMENTS (en ordre de temps de retention); longueur d'onde;observations
1. Chlorophyll c3; 450    
2. Chlorophyllide a; 667; coelution avec chlc1+c2
3. Chlorophyll c1+c2; 450    
4. Phaeophorbide; 667; coelution avec peridinin
5. Peridinin; 450    
6. 19’-butanoyloxyfucoxanthin; 450    
7. Fucoxanthin; 450    

8. Neoxanthin, 450

9. Prasinoxanthin, 450
10. Violaxanthin; 450
11. 19’-hexanoyloxyfucoxanthin; 450
12. Diadinoxanthin; 450    
13. Alloxanthin; 450    
14. Diatoxanthin; 450    
15. Zeaxanthin; 450    
16. Lutein; 450    
17. Bacteriochlorophyll a; 770
18. Total chlorophyll b = chlorophyll b + divinyl chlorophyll b; 450; coelution
19. Divinyl chlorophyll a; 667  
20. Chlorophyll a = chlorophyll a + allomers + epimers; 667    
21. Carotenes = α-caroten + β-caroten; 450; coelution
22. Phaeophytin a; 667    

Les limites de detection de la chlorophylle a and fucoxanthine (basées sur un rapport signal/bruit de 3 et un volume filtré de 2L) ont été estimées à 0.002 mg.m^-3 and 0.004 mg.m^-3 respectivement.

 

Références

Ras J, Uitz, J, and H. Claustre (2008). Spatial variability of phytoplankton pigment distributions in the Subtropical South Pacific Ocean: comparison between in situ and modelled data. Biogeosciences, 5, 353-369.